Modele keops

Subventions de la Fondation des instituts de recherche en santé du Canada (IRSC) [FDN 143277 à la P.E., FDN 143343 à D.D.]; Subvention de fonctionnement des IRSC [MOP-67189 à A.G.]; Instituts nationaux de santé [P41 GM103403 à NE-CAT]; NIH-ORIP HEI Grant pour le détecteur Pilatus 6M sur la ligne de faisceau 24-ID-C [S10 RR029205]; Financement APS [DE-AC02-06CH11357]. Financement des frais d`accès libre: subvention de la Fondation IRSC FDN 143277. L`extension PCR de chevauchement a été utilisée pour générer des fragments d`ADN de ribozyme du virus de l`hépatite Delta (HDV) de MJ tRNALYS (AAA). Le fragment de ribozyme mjtRNALys – HDV a été ligné en pUC19 et linéarisé avec BamHI avant d`effectuer des réactions de transcription in vitro à l`aide de l`ARN polymérase T7. Les conditions de la réaction de transcription étaient les suivantes: 100 mM Tris pH 8,0, 4 mm ATP, 4 mm GTP, 4 mm CTP, 4 mm UTP, 10 mM DTT, 1 mM spermidine, 0,1% Triton X-100, 25 mM MgCl2, 30 ug/ml modèle d`ADN linéarisé, 0,2 mg/ml T7 RNA polymérase , 10 U/ml de phosphate inorganique thermostable (NEB) et 200 U/ml d`inhibiteur de RNase RiboLock™ (Thermo Scientific). Les réactions de transcription ont été incubées pendant quatre heures à 37 ° c et terminées par l`addition d`EDTA à une concentration finale de 50 mM. L`ARN a été isolé à l`aide d`un protocole conventionnel d`extraction phénol – chloroforme, suivi de précipitations d`isopropanol et de 80% de lavages à l`éthanol. Les pastilles d`ARN séchées à l`air ont été solubilisées en 8M d`urée et repliées par dilution rapide en neuf volumes de 25 mM de bis-Tris pH 6,5, 1 mM MgCl2 et 0,2 mM EDTA. Le tRNA replié a été purifié sur une colonne Source15Q (GE Healthcare) en utilisant les conditions de chromatographie suivantes: (i) quatre CV à 20% B et (II) gradient linéaire sur 25 CV de 20 à 30% B. les solutions A et B sont des eaux traitées au DEPC et 2 M de NaCl préparés dans des l`eau, respectivement. Les fractions contenant du tRNA ont été regroupées et traitées avec un volume d`isopropanol pour précipiter l`ARN.

L`ARN précipité a été granulé à l`aide de centrifugation, lavé avec 80% d`éthanol puis séché à l`air. Le culot de l`ARN a été resuspendu en 50 mM Tris – Cl pH 8. Avant l`utilisation, le tRNA a été replié par (i) ébullition à 95 ° c pendant 2 min, (II) refroidissement par Flash sur glace, (III) réchauffement à 50 ° c, (IV) addition de MgCl2 à une concentration finale de 2 mM et (v) Refroidissement lent à température ambiante. . Nous avons démontré que l`utilisation de trois sgRNA différents en commun ciblant le même gène entraîne une mutagenèse presque complète du gène respectif dans l`embryon de zébrafish entier. En revanche, les taux de mutagenèse sont inférieurs pour la plupart des Sgrna individuels. En outre, la probabilité de porter au moins une mutation de déphasage sur chaque allèle est significativement améliorée par rapport à chaque sgrna individuel (Fig. 2).

Cependant, nous avons constaté que le KO multi-sgRNA aigu pour l`osgep et le tprkb montrait encore un phénotype moins important que les lignées KO stables pour l`osgep et le tprkb (figures 4 et 5, [15]). La différence de phénotype de survie et de microcéphalie entre le KO multi-sgRNA aigu et les lignées KO stables pourrait s`expliquer par l`existence d`un gène KO complet par une mutation de troncation homozygote dans la lignée stable, contrairement à un génotype de mosaïque dans le multi-sgRNA aigu KO avec un mélange de mutations de troncation et de non-troncation (figures 1 et 2).

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